Гистохимическое выявление полисахаридов. Приготовление реактива Шиффа и проведение шик-реакции
Полисахариды - высокомолекулярные сахара, встречающиеся в тканях организма как в чистом виде (гликоген), так и в соединении с другими веществами (гликопротеиды, протеогликаны).
Наиболее распространенными методами выявления полисахаридов являются: окраска объектов кармином по Бесту и ШИК-реакция.
1. Выявление кармином по методу Беста - эмпирический способ и не отвечает строгим гистохимическим требованиям. Он широко распространен в гистохимической практике благодаря доступности и яркости. Метод основан на окраске срезов, залитых в парафин или целлоидин, водным раствором кармина. В результате гликоген окрашивается в ярко-красный цвет. При окраске кармином кроме гликогена могут окрашиваться некоторые клеточные гранулы, слизь, кутикулярные каемки эпителия и др. Поэтому всегда следует ставить контроль с диастазой.
2. ШИК - реакция (ШИФФ-йодная кислота). Метод основан на том, что периодат калия при воздействии на полисахариды избирательно окисляет спиртовые группы углеродных атомов гексозной части, превращая их в альдегидные. Свободные альдегидные группы затем реагируют с фуксин-сернистой кислотой, давая фиолетово-вишневое окрашивание.
Приготовление растворов:
1. Реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота. 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл дистиллированной воды (комнатной температуры), тщательно взбалтывая в течение 3-5 мин. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. К фильтрату добавляют 10 мл 1 н. хлористоводородной кислоты и 1 г метабисульфита калия или натрия. Раствор в хорошо закрытой колбе помещают в темное место на 24 ч. После обесцвечивания фуксина реактив приобретает желтоватый или коричневый цвет в зависимости от качества основного фуксина. Для окончательной очистки фуксина от примесей добавляют к нему 3-5 растолченных таблеток активированного угля, хорошо взбалтывают и отфильтровывают в склянку с притертой пробкой. Реактив лучше хранить в холодильнике. С целью проверки качества полученного реактива Шиффа наливают в бюкс 5 мл реактива и добавляют в него 1 каплю неразведенного кислого формалина. Если реактив отличного качества, то он на глазах приобретает цвет основного фуксина.
2. Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл 10% раствора гидросульфита натрия (Na2SO3) и 10 мл 1 н. раствора хлористоводородной кислоты. Сернистая вода готовится перед употреблением и должна обладать характерным запахом диоксида серы (сернистого ангидрида (SO2).
Методика проведения окраски препаратов:
1. Материал фиксируют в 10 % формалине, жидкостях Карнуа, Ценкера, заливают в парафин.
2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды.
3. При комнатной температуре срезы окисляют 0,5-1 % водным перийодатом калия в течение 2 -10 мин. Раствор хранят в темноте. Рабочую концентрацию этого раствора и продолжительность инкубации в ней подбирают в зависимости от объекта.
4. Промывают в дистиллированной воде 10 мин.
5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 10-30 мин при комнатной температуре в темноте.
6. Срезы промывают сернистой водой три раза по 2 мин. Сернистую воду можно также готовить (непосредственно до проведения реакции).
7. Тщательно промывают в проточной и дистиллированной воде, ядра можно докрасить 0,5 % светлым зеленым или гематоксилином.
8. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, заключают в бальзам.
Результат: углеводы, содержащие гексозу, окрашиваются в красно-лиловый цвет, гликоген - в более интенсивный темно-красный.
Контроль: расщепление гликогена амилазой или диастазой, реакция ацетилирования для блокирования гидроксильных групп.
Необходимо пользоваться химически чистой посудой, стеклянными палочками; нельзя работать с металлическими крючками или иголками; окрашивание срезов в реактиве Шиффа следует проводить в темноте.
При обильном выявлении ШИК-позитивного вещества цитоплазма клеток гомогенно окрашивается в фиолетово-вишневый цвет.
Метод Шифф - йодная кислота
Метод Шифф — йодная кислота применяется для выявления гликогена и нейтральных МПС. Наиболее распространена модификация Хочкисса и МакМануса.
Фиксация и способы приготовления срезов различны. Срезы из дистиллированной воды переносят на 15 мин в раствор нерйодата натрия или калия (350 мг перйодата калия или натрия + 50 мл дистиллированной воды + 0,5 мл 35% азотной кислоты), затем быстро ополаскивают в двух порциях дистиллированной воды и помещают на 5 мин в раствор сернистой воды (1,5 г метабисульфита натрия + 300 мл дистиллированной воды + 15 мл 1 и раствора соляной кислоты). После этого переносят в реактив Шиффа на 30 — 60 мин и снова в сернистую воду (три порции по 5 мин в каждой).
Затем выдерживают в дистиллированной воде до покраснения срезов, докрашивают ядра гематоксилином Эрлиха, разведенным до цвета мадеры, в течение 5 мин н промывают в водопроводной воде до посинения срезов.
Ополаскивают дистиллированной водой, проводят через спирты восходящей концентрации (70, 96, 100%), просветляют в ксилоле в течение 10 — 12 ч, заключают в канадский бальзам. Для идентификации гликогена и нейтральных МПС контрольные срезы перед окраской обрабатывают амилазой слюны или диастазой, затем красят, как указано выше.
Приготовление раствора Шиффа
1 г основного фуксина, растертого в ступке, помещают в 200 мл кипящей дистиллированной воды, встряхивают в течение 5 мин, охлаждают до 50 °С, фильтруют, добавляют вначале 20 мл 1 н. раствора хлористоводородной (соляной) кислоты, охлаждают до 25 °С, затем 1 г метабисульфата натрия или калия.
Оставляют в темноте на 14 — 24 ч, затем добавляют 2 г активированного угля, встряхивают в течение 1 мин, снова фильтруют и ставят в холодильник. Раствор должен быть бесцветным. Сернистую воду и перйодат калия или натрия рекомендуется готовить непосредственно перед употреблением.
«Патоморфологическая диагностика заболеваний кожи»,
Г.М.Цветкова, В.К.Мордовцев
Фиксация различная. Парафиновые срезы на сутки помещают в 3% раствор перекиси водорода, затем на 15 — 20 мин в карболовый гематоксилин (гематоксилин 1,75 г + 200 мл дистиллированной воды + 5 г кристаллической карболовой кислоты + 10 мл 10% фосфорно-вольфрамовой кислоты), ополаскивают дистиллированной водой, дифференцируют в 10% растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты (до 1 сут), несколько часов…
Измельченные кусочки подвергаются предварительной фиксации в 4% глютаральдегиде, забуференном 0,1 М какодилатным буфером (рН 7,3) в течение 2 ч при температуре 4 °С. Хорошие результаты дает также применение 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,3). Затем кусочки промывают в 0,2 М растворе сахарозы па какодилатном буфере в течение 12 ч и фиксируют в течение 2 ч…
Фиксация особенного значения не имеет, срезы можно приготовить на замораживающем микротоме, а также после заливки в парафин. Перед окрашиванием их помещают в изотонический раствор хлорида натрия на 3 ч при температуре 37 °С, затем переносят в 0,5% раствор толуидинового синего на 18 ч. После этого срезы быстро промывают в трижды сменяемой дистиллированной воде, высушивают фильтровальной…
Биопсию кожи лучше производить циркулярным полном, который значительно упрощает взятие материала и не травмирует прилежащие участки. Для постановки патологоанатомического диагноза большое значение имеют правильная фиксация и последующая обработка биопсированного кусочка кожи. Лучшим фиксатором для обычных гистологических целей является 10% нейтральный формалин. Его количество должно превышать в 50 раз объем биоптата. Так, биоптат размером 1 X…
Гистохимические методы исследования в основном применяются для научных целей, однако некоторые из них имеют диагностическое значение, как, на пример, ШИК-реакция, окраска альциановым голубым или толуидиновым синим, азаном по методу Гейденгайна и др. С помощью ШИК-реакции выявляют полисахариды: гликоген и муконолисахариды (МПС), особенно нейтральные. Эта реакция необходима для определения ШИК-положительных фибриноида и фибрина. Грибы и хитиновые…
ШИФФА РЕАКТИВ
Водный р-р фуксинсернистой к-ты (ф-лы I или II). Служит для качественного обнаружения альдегидов. При взаимод. Ш. р. с альдегидом RCHO образуется пурпурно-фиолетовый краситель (ф-ла III).
Р-ция очень чувствительна (напр., можно определить 1 мкг формальдегида). В то же время ароматич. гидроксиальдегиды, многие непредельные не дают окрашивание. Нек-рые (напр., ), непредельные соед., неорг. и орг. основания, ряд солей, способных к гидролизу, и все соед., окисляющие сернистую к-ту, приводят к образованию розовой окраски. Поэтому появление светло-розовой окраски нельзя считать положит. пробой на альдегид.
Ш. р. получают пропусканием SO 2 в 0,025%-ный водный р-р фуксина до обесцвечивания. При определении альдегидных групп необходимо предварит. довести кислотность до рН 3 путем добавления в Ш. р. к-ты или буферной смеси. Обычно проводят контрольный опыт. При нагр. р-р фуксин-сернистой к-ты может краснеть.
Р-ция, лежащая в основе использования Ш. р., открыта Г. Шиффом в 1864.
Лит.: Губен- Вейль, Методы органической химии, пер. с нем., 4 изд., т. 2. Методы анализа, М., 1963, с. 431-32; Идентификация органических соединений, пер. с англ., М., 1983, с. 195-96; Мазор Л., Методы органического анализа, пер. с англ., М., 1986, с. 122-24.
Я. А . Куцева.
Химическая энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия . Под ред. И. Л. Кнунянца . 1988 .
Смотреть что такое "ШИФФА РЕАКТИВ" в других словарях:
- (H. Schiff; синоним фуксинсернистая кислота) реактив для качественного определения альдегидной группы органических соединений, открытый Хуго Шиффом. Содержание 1 Получение 2 Хранение … Википедия
- (Н. Schiff, 1834 1915, нем. биохимик) реактив для качественного определения альдегидной группы органических веществ, представляющий собой раствор фуксинсернистой кислоты; используется для гистохимического выявления углеводов и… … Большой медицинский словарь
реактив Шиффа - фуксинсернистая кислота Реактив, предназначенный для качественного определения альдегидных групп; применяется в реакции Фельгена при выявлении ДНК, а также в ряде др. тестов (на гликоген и др.). [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо русский… … Справочник технического переводчика
Schiff’s reagent реактив Шиффа, фуксинсернистая кислота. Pеактив, предназначенный для качественного определения альдегидных групп; применяется в реакции Фельгена
Водный раствор фуксина, обесцвеченный диоксидом серы. В присутствии альдегидов этот раствор окрашивается в синий цвет.
Реакция Фельгена указывает на присутствие ДНК, поэтому она прежде всего может быть использована для констатации наличия или отсутствия ядер в клетках, их размеров, формы, местоположения и т. д. Кроме того, интенсивность окрашивания может дать косвенные указания на количественные изменения ДНК.
Реактив Шиффа - фуксинсернистая кислота - является характерным реактивом на альдегиды. На свойстве реактива Шиффа взаимодействовать с альдегидными группами основана и реакция Фельгена с этим реактивом на ДНК. Однако, ввиду того что в молекуле ДНК альдегидные группы связаны, их надо предварительно освободить. Это достигается проведением гидролиза ДНК слабой кислотой, в результате которого происходит отщеплейие пуриновых оснований (аденина, гуанина) от молекулы ДНК и образуется остаток молекулы ДНК со свободными альдегидными группами:
Изменения возникают у первого углеродного атома дезоксирибозы; в месте отрыва пуриновых оснований выявляется потенциальная альдегидная группа. При. этом фуранозная форма дезоксирибозы превращается в форму нециклического сахара. В процессе реакции к двум альдегидным группам дезоксирибозы присоединяется одна молекула фуксинсернистой кислоты.
Фуксинсернистая кислота (лейкофуксин) получается из кислого раствора основного фуксина (парафуксина) в 1 н. соляной кислоте при насыщении его сернистым ангидридом. Сернистый ангидрид образуется при взаимодействии соляной кислоты с бисульфитом натрия, которые вносятся в кислый раствор основного фуксина:
HCl+NaHSO 3 =NaCl+SO 2 +H 2 O
При пропускании сернистого газа в раствор фуксина нарушаются две двойные связи, в одном из трех ароматических колец фуксина исчезает хиноидная группировка, а вместе с ней и лилово-красная окраска, свойственная фуксину. Фуксинсернистая кислота - непрочное бесцветное соединение.
Получение фуксинсернистой кислоты из основного фуксина протекает следующим образом: фуксин, взаимодействуя с соляной кислотой, образует комплексное соединение, которое далее реагирует с сернистой кислотой по следующей схеме:
Таким образом, при образовании фуксинсернистой кислоты к фуксину присоединяются две группы (-SO 2 H).
При реакции с альдегидами хиноидная группировка восстанавливается, так как фуксинсернистая кислота - неустойчивое соединение, разлагается с образованием сернистой кислоты.
При взаимодействии одной молекулы фуксинсернистой кислоты с двумя молекулами остатков ДНК, имеющих обнаженные альдегидные группы, получается одна молекула окрашенного соединения.
При подготовке материала для проведения реакции Фельгена обычно рекомендуют фиксацию в спиртовых и кислых фиксаторах. Чаще всего применяют фиксатор Карнуа (стр. 45). Такой фиксатор осаждает нуклеопротеиды, что приводит к удачным морфологическим картинам. Однако длительное пребывание материала в фиксаторе вызывает разрушение связи между нуклеиновыми кислотами и белками, приводит к постепенной экстракции нуклеиновых кислот и дает искаженную картину. Поэтому пребывание в фиксаторе надо максимально ограничивать.
Реактивы
1) Реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота).
Приготовление реактива Шиффа. 1 г основного фуксина растереть в ступке и растворить в 200 мл кипящей дистиллированной воды; охладить до 50°С. В охлажденный раствор добавить 20 мл 1 н. соляной кислоты * и охладить до 25°С. Добавить 1 г бисульфита или метабисульфита натрия. Полученную смесь взболтать с активированным углем (от 1 да 3 мин) и профильтровать. Налить в темный или завернутый в темную бумагу сосуд, закрыть его притертой пробкой и поместить в темноту на 12 или более часов до обесцвечивания основного фуксина и образования фуксинсернистой кислоты.
* (1 н. соляная кислота соответствует 10%-ному раствору, приготовленному из концентрированной соляной кислоты (уд. в. 1,19) )
2) Сернистая вода.
Приготовление сернистой воды. К 200 мл дистиллированной воды добавить 20 мл 1 н. соляной кислоты и 1 г бисульфита натрия.
3) 1 н. соляная кислота.
4) Среды для обезвоживания объектов и заключения их в канадский бальзам (стр. 66-70).
5) Канадский бальзам.
Проведение реакции
* (См. сноску на стр. 118. )
1. Погрузить препараты в 1 н. соляную кислоту на несколько секунд.
2. Перенести их в заранее нагретую до 60° С 1 н. HCl и поместить в термостат при температуре 60° С (или на водяную баню с такой же температурой) на 5-10 мин * .
* (Длительность гидролиза зависит от примененного фиксатора. При употреблении фиксатора Карнуа и формалина оптимальное время 8 мин. )
3. Сполоснуть препараты холодной 1 н. HCl.
4. Поместить их в реактив Шиффа на 1 ч.
5. Отмыть избыток реактива Шиффа сернистой водой (3 смены по 3-5 мин).
6. Промывать препараты в водопроводной воде в течение 5-10 мин, сменяя начинающую розоветь воду.
7. Довести препараты до бальзама через 96%-ный, 100%-ный спирт, смесь спирта с ксилолом и ксилол.
8. Наблюдать появление малиновой окраски.
Результаты реакции (табл. 20)
В кончике корешка лука ядра приобретают малиново-фиолетовую окраску. Ядра зоны растяжения и особенно всасывания выглядят несколько менее яркими, чем ядра зоны деления. Ядрышки, цитоплазма и оболочки клеток остаются неокрашенными.
В зерновке кукурузы ядра корешка, почечки и всех остальных тканей зародыша, а также клеток алейронового слоя окрашиваются в характерный для реакции Фельгена цвет. Сплюснутые и растянутые ядра клеток эндосперма окрашиваются более бледно.
Реактив Шиффа.
Что это такое?
Реактив Шиффа – это раствор, который химически соединяется с альдегидами, формируя ярко красный продукт. Строго говоря, кетоны также реагируют, но для всех практических целей их можно игнорировать. Многие компоненты ткани могут быть окрашены этим путем. Реактив Шиффа сделан из парарозанилина, обработанного сернистой кислотой (H2SO3). Это причина разрушения хромофора дополнением сульфональной кислотной группы к центральному углероду. Сернистая кислота образуется, растворением диоксида серы (SO2) в воде.
В некоторых, обычно старых текстах, Вы найдете реактив Шиффа, упомянутый как лейкофуксин . Приставка лейко означает белый и относится к потере окраски раствором. Однако,leucobase относится к восстановленным соединениям, и цвет его восстанавливается окислением. Реактив Шиффа не имеет в оригинале цвета парарозанилина. Скорее, новый цветной состав производится химической комбинацией с альдегидом. По этой причине это обычно теперь именуется это как реактив Шиффа или фуксинсернистая кислота.
Кажется, нет большой разницы относительно источника сернистой кислоты. Поскольку это - просто диоксид серы, растворенный в воде. Есть несколько способов получить ее. Четыре процедуры, которые рекомендовали:
· Газ диоксида серы из цилиндра медленно барботируется через раствор парарозанилина, пока раствор не начинает изменять цвет. Затем контейнер тщательно закрывается и выдерживается в темном месте, обычно до утра или дольше.
· Покупается уже готовый раствор сернистой кислоты. Парарозанилин растворяется в нем без высокой температуры. Затем контейнер тщательно закрывается и выдерживается в темном месте, обычно до утра или дольше.
· Натрия или калия метабисульфит или сульфит (коммерческие образцы которого, очевидно, составлены, главным образом, из метабисульфита), добавляются к раствору парарозанилина. Соляная кислота добавляется, производя диоксид серы в растворе. Затем контейнер тщательно закрывается и выдерживается в темном месте, обычно до утра или дольше.
Реактивы, которые разлагаются в растворе, производящем диоксид серы, типа натрия гидросульфита (дитионита) или тионил хлорида, добавляются к раствору парарозанилина. Затем контейнер тщательно закрывается и выдерживается в темном месте, обычно до утра или дольше.
|
Реактив Шиффа должен быть бесцветным или очень бледно желтым. Однако парарозанилин может содержать другие красители, особенно если они от образца основного фуксина, который является смесью. Другие красители представлены обычно гомологами парарозанилина, типа розанилина и маджента II, но производят глубокие янтарные растворы и могут красить альдегиды в коричневато красные цвета. Эти более темные продукты могут быть удалены добавкой малого количества порошка активированного древесного угля , встряхиванием раствора в течение минуты и фильтрованием. Иногда эта обработка не работает, и раствор остается коричневым. К сожалению, если добавляется достаточно древесного угля, чтобы полностью удалить весь коричневый цвет обесцвечиванием, окончательный прозрачный раствор может только давать очень бледную окраску. Обычно это означает, что использовался образец основного фуксина, который содержит большие количества одного из других красителей. Если возможно, покупайте образцы основного фуксина, указанного как пригодный для реактива Шиффа, или покупайте парарозанилин. Как был заявлено выше, реактив Шиффа комбинируется с альдегидами, производя ярко красный продукт. В гистологии эти альдегиды присоединяются, или образуются из структур ткани, окрашиваясь в очень ярко красный цвет. Для всех альдегидов в тканях механизм тот же самый. Альдегид конденсируется с реактивом Шиффа, чтобы образовать новое соединение, присоединяясь к ткани. В процессе преобразуется хромофор, и он производит цвет.
Новый красный продукт показан двумя формулами. Большинство объяснений дает первая – это конечный продукт . Однако некоторые тексты дают альтернативное представление, включающее один альдегид. В любом случае окрашенный продукт состоит из реактива Шиффа, альдегида и реактива, к которому присоединен альдегид. Kiernan сообщил, что последние исследования указывают, что изделие отличается от вышеупомянутого, и существует как таутомер двух продуктов, представленных ниже.
Чтобы сделать реактивы типа Шиффа, могут быть использованы другие красители. Они упоминаются часто как псевдо-Шифф реактивы. Обычно они окрашены, не полностью обесцвечены, хотя цвет и прозрачность раствора часто изменяются. Возможно, что остаточные цветные составы в этих растворах могут окрасить ткани по ионному механизму. Чтобы удалять этот окраску, общепринято обработать срезы кислым спиртом после окраски. Любая окраска, остающаяся после обработки кислым спиртом - положительная реакция от псевдо-Шифф реактива. Ни один из этих псевдо-Шифф реактивов не получил распространения, мало-мальски приближающегося к популярности парарозанилинового реактива Шиффа, и этот раствор остается стандартом. Причина - яркая и ясная красная окраска парарозанилиновым реактивом Шиффа. Другие красители дают слабый цвет, хотя немногие по-настоящему эффективны. Растворы, которые получили большее распространение, сделаны с флуоресцентным красителем, акрифлавином (см. ниже), например. Они позволяют получить флуоресцентный положительный результат, который может быть очень полезен для того, чтобы демонстрировать материалы типа грибов, например, которые могут присутствовать в маленьких количествах. Culing дает список многих из этих красителей, несколько из которых внесены здесь в список. За дополнительной информацией обратитесь к трудам Kasten, указанным ниже Culing.
Когда ткани удалены из реактива Шиффа и отмыты, их неизбежно переносят в промывочную жидкость. Если используется вода из-под крана, реактив быстро изменяет окраску, и вода становится очень красной. Изначально имелись некоторые беспокойства, что этот повторно красящий реактив Шиффа будет вести себя как основной краситель и окрашивать ткани, давая ложно положительные результаты. По этой причине рекомендовались полоскания в сульфите. Они растворяют сернистую кислоту, и используются, чтобы отмыть реактив Шиффа в течение нескольких минут, растворяя ее достаточно хорошо перед мытьем тканей в воде, гарантируя, что нет никакой вероятности неальдегидной окраски. Опыт многих лет показал, что эти полоскания не необходимы и удовлетворительна хорошая отмывка в водопроводной воде, если срезы не остаются в реактиве Шиффа, восстановившем цвет. Если используется псевдо-Шифф реактив, то срезы нужно обработать 1% соляной кислотой в 70% этаноле в течение 5-10 минут после этой промывки. Некоторые из них окрашиваются, не могут быть полностью обесцвечены и могут красить по ионному механизму. Кислый спирт удаляет любую такую окраску. После обработки кислым спиртом срезы должны быть вымыты с водой из-под крана как обычно. Хотя реактив Шиффа используется, чтобы обнаружить альдегиды, они обычно не найдены свободными в тканях, и должны быть произведены некоторым способом. Есть три способа, которыми это может быть сделано. Первый, и, безусловно, наиболее обычный, окисление некоторых компонентов ткани. Это производит группы альдегида, позволяя демонстрироваться материалу, к которому присоединен компонент. Второй путь состоит в том, чтобы обработать срезы кислотами, чтобы преобразовать некоторые из дезоксирибоз в ДНК и альдегиды и затем окрасить их с реактивом Шиффа. Третий – нужно приложить альдегид непосредственно к тканям, обычно белок, затем демонстрировать альдегид с реактивом Шиффа. Этот последний может быть замечен легко с глутаральдегидной фиксацией для световой микроскопии. Глутаральдегид имеет две альдегидных группы и, если притягиваются молекулы в ткань одной из них, другая остается несвязанной, когда завершается фиксация. Из-за этого, с любой процедурой, с использованием реактива Шиффа, одиночные альдегиды будут реагировать с ним, производя глубокий розовый фон. Так, прежде чем реактив Шиффа может быть применен к этим срезам, альдегиды должны быть блокированы, так они не могут реагировать. При любом точном применении, используя этот реактив, нужно использовать два контроля. Первый – срез, к которому было применено блокирование альдегида. Второй – срез, в котором реактив Шиффа был применен к ткани без любой предварительной обработки. Первый срез, таким образом, блокирует любые альдегиды существовавшие ранее, в то время как второй выделяет места, где они были расположены. Кроме того, конечно, должны использоваться срезы с установленным отрицательным и положительным контролем для целевого элемента ткани. Если эти два последние контроля не окрашиваются, как ожидается, то реактив Шиффа, и никакие другие, должен быть исследован, чтобы гарантировать, что он не испортился, и подходит для использования. Histochemistry: Theoretical and Applied Ed. 3 Pearse, A. G. E., 1968, 1972, v.1, pp.448 Churchill Livingstone, Edingburgh, London, UK Histological and histochemical methods: Theory and practice Ed. 3 Kiernan. J. A., 1999, pp.203 Butterworth Heinemann Oxford, UK. Handbook of histopathological and histochemical techniques
Ed. 3 Culling C. F.A., 1974, pp.249, 250 Butterworth London, UK. http://stainsfile. info/StainsFile/stain/schiff/schiffwhatis. htm Реакция периодная кислота – Шифф Периодная кислота – Шифф реакция (ШИК) используется, чтобы демонстрировать присутствие 1,2 гликолей, и, следовательно, является важным методом в гистохимии углеводов и гистологической демонстрации многих структур. Растворы Фиксация и проводка Большинство фиксаторов и методов проводки удовлетворительны. Метод 1. Довести срезы до воды через ксилол и этанол. 2. Поместить в периодную кислоту в течение 10-30 минут. 3. Полоскать хорошо в воде из-под крана. 4. Полоскать в дистиллированной воде. 5. Поместить в реактив Шиффа на 10-30 минут. 6. Отмыть дистиллированной водой. 7. Вымыть хорошо в воде из-под крана приблизительно 10 минут. 8. Докрасить гемалауном Майера 2 минуты. 9. Отмыть хорошо водой из-под крана, пока гемалаун Майера не посинеет. 10. Обезводить этанолом, просветлить ксилолом и заключить в смолистую среду. Ожидаемые результаты Примечания · Глутаральдегидные фиксаторы освобождают свободные альдегидные группы притягивая их к тканям. Они вызывают полную ложноположительную реакцию. Это нужно остановить от реакции соответствующей процедурой типа анилиново-уксусного блокирования. · Вода из-под крана в шаге 7 необходима для развития красного цвета. В определенных рамках, более длительное промывание дает более темный цвет. · Первоначально, рекомендовалось, чтобы реактив Шиффа был отмыт, растворением сернистой кислоты (сульфитное полоскание). Пока вода возвращает цвет реактиву Шиффа, предполагалось, что отмываемая вода, могла вести к ложноположительным результатам. Теперь известно, что дело обстоит не так, если реактив Шиффа удален быстро, и срезы не остаются в загрязненной им воде надолго. Следующий список, также составленный Culling, дает ШИК-положительные материалы, обычно с которыми сталкиваются, хотя, он не является исчерпывающим:
citing: Hotchkiss, R. D., 1948 Arch. Biochem, vol 16, pp 131 http://stainsfile. info/StainsFile/stain/schiff/pas-standard. htm Последнее обновление Август 2003. |
